限制性内切酶

底物DNA没有被所用限制酶切断，为什么?

可以考虑以下几种情况： (1) 底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA，碱基易发生缺失、变化等。 (2) 限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响，请参考甲基化对限制酶活性影响的表格，其中做了详细说明。 (3) 底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下，底物DNA须重新进行纯化。 (4) 限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置，对酶切反应也有一定的影响。 (5) PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换Buffer，避免PCR产物中带入的其它物质影响酶切反应。据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。 (6) 不同公司的酶和Buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。

限制酶可以稀释使用吗?

不稀释为好，限制酶都根据最佳反应体系配制了浓度。酶制品稀释时，酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA不能切断的现象。

限制酶活性定义的1 U是在37℃条件下，经1小时，将1 μg λ DNA完全切断的酶量，对所有的底物DNA都可以完全切开吗?

由于底物DNA的不同，其含有的酶切位点的摩尔浓度不同，空间结构也不相同，这些，都会对酶切反应的速度产生影响，所以，相同的酶量，不一定能将不同的底物切开。

底物DNA经酶切后，电泳无条带或出现Smear现象，如何解决?

底物DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase发挥作用，将底物DNA降解。可以使用其他限制酶酶切底物DNA，也可以使用此酶切其他底物DNA，来验证酶和底物DNA是否有问题。如果质粒酶切出现此情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。

酶切产物是否可以用苯酚/氯仿抽提、切胶回收和片段回收试剂盒纯化?

以上的纯化方式都可以对酶切产物进行纯化。但是一般苯酚/氯仿抽提和切胶回收的损失比较大。分步酶切的中间产物可以使用乙醇沉淀和片段回收试剂盒（在允许纯化的片段长度范围内使用）进行纯化，这样操作可以减少损失。

限制酶的反应体系是否可以缩小?

不建议缩小酶切反应体系，酶切体系过小可能会影响酶切效果。

使用限制酶是否可以进行长时间酶切反应?

限制酶酶切时间不宜过长。如果需要延长酶切时间，建议时间不要超过“不产生Star Activity的时间”，具体信息可以参考制品说明书。

进行双酶切时限制酶的使用量是多少? 如果两种酶的反应温度不同，如何操作?

使用限制酶进行双酶切时，两种酶的总加量不超过反应体系的1/10。 如果各酶的反应温度不同，建议按低温到高温的顺序加入相应的QuickCut限制酶进行分步酶切反应。

限制酶、DNA底物的使用量、浓度及酶切时间为多少比较好？

每种限制酶、DNA底物的标准使用量，请参考说明书中“一般反应体系”内容。 限制酶的活性单位是按照反应1小时定义的，通常建议反应时间从1小时至几小时。反应中使用的标准酶量是反应体系的1/20体积量。如果要增加酶的使用量，请控制在反应体系的1/10体积量以下。限制酶溶液中的甘油如果过量（5%以上）引入到反应液中，会影响限制酶识别DNA序列，从而导致不正确的序列识别，产生非特异性酶切。如果使用的酶量(U)相对于DNA底物不足，则需要更长的酶切反应时间。另外，限制酶的活性受到识别位点前后序列的影响，酶切难易程度不同。