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①模板引物的原因：确保模板、引物的品质，保证没有降解。另外，如果模板含有较多的抑制物时（如植物基因组模板），推荐使用抗抑制能力强的PCR酶；还可以对模板进行梯度稀释后扩增，摸索合适的模板用量。
②反应体系与条件的原因：增加循环数、降低退火温度、适当提高Mg2+工作浓度，都可以提高扩增效率，但同时会导致特异性与保真性下降，需要根据具体的实验要求优化合适的条件。
①选择热启动酶：与普通PCR酶相比，热启动酶具有更高的扩增效率和特异性。
②优化反应体系与条件：升高退火温度可以有效提高特异性。另外减少循环数、适当降低Mg2+工作浓度，也可以提高特异性，但都会导致扩增效率的下降，需要根据具体的实验要求优化合适的条件。
寡核苷酸应该在含有7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶上检测，并且应该与50%的甲酰胺溶液一起上样以避免压缩和形成二级结构。长度相同但是组成不同的寡核苷酸可以产生不同的电泳结果。dC的迁移最快，其次是dA、dT，最慢的是dG。带有核糖核酸的寡核苷酸容易产生模糊的电泳条带，并且通常存在二级结构问题。
样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。裂解混合液可在2-8℃保存5天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
建议按以下顺序排查：
RNA模板质量：检查RNA是否降解；确保模板用量在推荐范围内（10 pg–2 μg）。
模板类型：确认使用的是总RNA或富集miRNA，而非已去除小RNA的RNA样品。
反应体系：确认各组分是否正确添加，关键酶组分是否置于冰上操作。
反应程序：确认孵育温度和时间是否正确。
常见Anchored Oligo(dT)₂₃VN和Random Primers两种引物，可根据实验需求灵活选择：
Oligo(dT)引物：特异性结合于mRNA的Poly(A)尾，适用于绝大多数真核生物mRNA的逆转录，特别适合全长cDNA合成。
随机引物：可结合RNA模板的多个位点，适用于不含Poly(A)尾的RNA（如原核RNA、rRNA等）以及mRNA 5′端区域的逆转录。
混合使用：将两种引物混合使用可兼具两者优势，提高覆盖度和cDNA得率。
可能的原因包括：
基因组DNA污染：RNA提取过程中残留的基因组DNA被PCR扩增。建议使用DNase I对RNA样本进行预处理，或使用带gDNA去除功能的逆转录试剂盒。
引物二聚体或非特异性扩增：检查qPCR引物设计是否合理，必要时重新设计。
试剂污染：更换新的无核酸酶水和引物重复实验，在超净工作台内配制反应体系，减少气溶胶污染。
可能原因及解决方案：
cDNA模板浓度过高：建议将cDNA适当稀释（5–10倍）后再进行qPCR。
引物浓度不适宜：建议miRNA特异性正向引物的终浓度约为200 nM。
反应体系配制不均：建议使用预混液形式减少加样误差，加样后充分混匀并短暂离心。
非特异性扩增：尝试将延伸温度从60℃提高至65℃。
引物二聚体：适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
