产品使用问题

BL21（DE3）不同于后两者，为大肠杆菌表达菌，用于高水平重组蛋白表达。

DH5α、TOP10均为常见大肠杆菌克隆菌，TOP10（基因型与DH10B高度类似）保留了mcrA基因座，因此在转化真核来源的甲基化DNA（如cDNA文库）时效率可能更高。而DH5α的hsdR突变则更适合转化通过PCR扩增获得的非甲基化DNA。对于常规质粒的扩增，两者功能基本可以互换。

表达菌感受态细胞转化活性低于克隆菌感受态细胞为正常现象，一般不超过一个数量级。在感受态细胞保存得当的前提下，实验用的正常载体得到的转化子数量可满足绝大多数实验场景。

两种酶的主要区别是E. coli DNA连接酶不能连接平末端dsDNA片段。两种酶均可用于修复双链DNA的单链切口以及进行粘末端连接。E. coli DNA连接酶通常被用于在第二链cDNA合成时进行切口修复，因为T4 DNA连接酶可能会导致嵌合插入的形成。

pPIC9K是整合型载体，需要通过同源重组整合到毕赤酵母的基因组上才能稳定存在和表达。根据你线性化载体所用的限制性内切酶，载体可以整合到不同的位点：

·使用SacI线性化：将表达盒整合到AOX1基因座。在GS115菌株中获得Mut⁺（甲醇利用正常型）表型；在KM71菌株中获得Mutˢ（甲醇利用慢型）表型。

·使用SalI或StuI线性化：将表达盒整合到his4基因座。在GS115中获得His⁺Mut⁺表型；在KM71中获得His⁺Mutˢ表型。

·使用BglII线性化：将表达盒整合到GS115的AOX1区域，获得Mutˢ表型。

不建议。限制酶都根据最佳反应体系配制了浓度。酶制品稀释时，酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会出现底物DNA不能切断的现象。

以上的纯化方式都可以对酶切产物进行纯化。但是一般苯酚/氯仿抽提和切胶回收的损失比较大。分步酶切的中间产物可以使用乙醇沉淀和片段回收试剂盒（在允许纯化的片段长度范围内使用）进行纯化，这样操作可以减少损失。

λ外切酶严格从双链DNA的5´末端起始消化，且偏好磷酸化的5´末端，对单链DNA无活性；T5外切酶不仅能从线性双链DNA的5´末端起始，还能从环状DNA的切刻或缺口处起始消化，并且具有单链DNA内切酶活性，底物范围更广。

两者均具有相似的ssDNA结合特性，但ET-SSB因含有单个OB-fold结构域及一个灵活的C端尾部结构，具有显著更强的热稳定性。E. coli-SSB在高于65℃时即失去大部分活性，而ET-SSB经95℃孵育60分钟后仍保持完全活性。此外，ET-SSB在溶液中主要以单体形式存在，结合ssDNA后才形成多聚体。

可作为PCR添加剂直接加入反应体系中。推荐在PCR反应前将ET SSB与模板、引物及缓冲液混合后再进行热循环。由于ET SSB具有极高的热稳定性，可耐受PCR全过程的高温变性步骤而无需在每轮循环后补加。具体用量需根据实验体系优化，建议从较低浓度开始进行梯度测试。

对于复杂模板，ET-SSB通过稳定ssDNA、防止其形成二级结构，并直接或间接作用于聚合酶以增加链置换活性和对引物模板的亲和力，从而有效改善富含GC等复杂模板的PCR性能。ET-SSB同样适用于多重PCR体系的优化。