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定点突变引物设计有哪些需要注意的地方？

引物总长度一般为25–45 bp，其中突变位点两侧的同源序列各占15–20 bp，确保退火特异性；此外，突变碱基应尽量设计在引物的中间区域。应注意每对引物仅需其中一条含有突变位点，且反向互补的引物不应涵盖突变区域。

如何提高多点突变的成功率？

成功率会受以下因素影响：

  • 突变位点间的距离（相距较远的位点效率更高）；

  • 突变类型（碱基替换效率优于插入/缺失）；

  • 质粒大小和序列复杂度；

建议在正式实验前设置小量预实验评估效率。

底物DNA没有被所用限制酶切断。

可以考虑以下几种情况：

  • 底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA，碱基易发生缺失、变化等。

  • 限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感，从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响，请参考甲基化对限制酶活性影响的表格，其中做了详细说明。

  • 底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质，会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下，底物DNA须重新进行纯化。

  • 限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置，对酶切反应也有一定的影响。

  • PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换Buffer，避免PCR产物中带入的其它物质影响酶切反应。据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。

  • 不同品牌的酶和Buffer不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。

限制酶、DNA底物的使用量、浓度及酶切时间为多少比较好？

每种限制酶、DNA底物的标准使用量，请参考说明书中“一般反应体系”内容。

限制酶的活性单位是按照反应1小时定义的，通常建议反应时间从1小时至几小时。反应中使用的标准酶量是反应体系的1/20体积量。如果要增加酶的使用量，请控制在反应体系的1/10体积量以下。限制酶溶液中的甘油如果过量（5%以上）引入到反应液中，会影响限制酶识别DNA序列，从而导致不正确的序列识别，产生非特异性酶切。如果使用的酶量(U)相对于DNA底物不足，则需要更长的酶切反应时间。另外，限制酶的活性受到识别位点前后序列的影响，酶切难易程度不同。

使用T5外切酶降解DNA时，如何终止反应？

可向反应体系中加入EDTA至终浓度≥11mM，螯合反应体系中的Mg²⁺离子，或加入含有SDS的DNA上样缓冲液，使SDS终浓度达到0.08%。

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