本产品专为miRNA的逆转录反应设计，采用高效的加A尾法原理。反应体系中，Poly(A)聚合酶首先对miRNA的3′末端进行多聚A尾修饰，随后配合Universal Oligo(dT)引物完成逆转录，精准生成miRNA的cDNA第一链。该试剂盒已将Poly(A)修饰与逆转录所需试剂全部整合，实现了真正的“一站式”操作。简捷的实验流程不仅降低了操作误差，更显著提升了miRNA检测的实验效率。
| 规格 | 组分 | 规格 | 数量 |
| B19011A | RNase-free ddH2O | 1 mL | 1 |
| B19021A | 2 × miRNA RT Mix | 250 μL | 1 |
| B19031A | HiScript miRNA Enzyme Mix | 50 μL | 1 |
| B19041A | Universal reverse Q primer（10 μM） | 625 μL | 1 |
注意：2 × miRNA RT Mix包含dNTP及逆转录所需引物，使用前需充分混匀；HiScript miRNA Enzyme Mix包含Poly(A)聚合酶、逆转录酶及RNase Inhibitor，对温度敏感，需置于冰上操作，使用后立即放回-20℃；Universal reverse Q primer为通用反向引物，配合特异性正向引物用于miRNA的qPCR检测。
-20℃保存，避免反复冻融。
本产品合成的cDNA适用于SYBR Green染料法及探针法qPCR，可用于miRNA表达谱分析、组织/细胞中miRNA表达水平检测及不同样本间miRNA差异表达分析等实验。
本试剂盒适用于哪些类型的RNA模板？
适用于总RNA或富集后的miRNA样品。加尾法可对样本中所有miRNA进行无差别逆转录，属于高通量逆转录。对于miRNA含量较低的样本（如血清、血浆等），提取后无需测浓度即可直接进行逆转录。模板投入量范围为10 pg–2 μg total RNA。
本试剂盒采用什么原理进行miRNA逆转录？
本试剂盒采用加A尾法原理。首先通过Poly(A)聚合酶在miRNA的3′末端添加多聚A尾，使其获得Poly(A)尾结构，随后使用含Oligo(dT)的通用逆转录引物结合于Poly(A)序列上，在逆转录酶作用下合成加长版cDNA第一链。加尾与逆转录一步完成。
加尾法逆转录有什么特点和优势？
加尾法可对样本中所有miRNA进行无差别逆转录，一次逆转录可检测多种miRNA。适用于多个miRNA（3个以上）的研究，如大量miRNA前期的筛选工作，一次逆转录即可进行多个靶标的qPCR扩增，节省样本量且更加方便。对于只检测1–2个miRNA的研究者，则可根据实际需求选择其他方法。
内参（如U6）的逆转录引物如何操作？
内参可与目的miRNA一起进行逆转录。本试剂盒提供U6内参的正向和反向引物，可在同一管反应中与目的miRNA共同完成逆转录，无需单独设置内参反应。操作时按说明书推荐的体系将内参引物与样本RNA一起加入即可。
逆转录反应的温度和时间如何设置？
推荐反应条件为42℃孵育15–30分钟。反应结束后于85℃孵育5分钟使酶失活。本试剂盒已将Poly(A)加尾和逆转录合并为一步完成，无需分步操作，简化了实验流程。
投入total RNA时，所有的RNA都会被加尾吗？
是的。加尾法会对样本中的所有RNA（包括miRNA及其他小RNA）进行无差别加尾。这也是加尾法可实现高通量检测的原因之一。但建议优先使用富集后的miRNA作为模板，以进一步提高检测特异性。
本试剂盒能否用于常规mRNA的逆转录？
不建议。本试剂盒是专门针对miRNA逆转录开发的，逆转录引物设计有差异，且逆转录酶经过定向改造，对较长的RNA模板逆转录效率较低。常规mRNA的逆转录请使用专门的mRNA逆转录试剂盒。
cDNA产量低或无产物，应如何排查？
建议按以下顺序排查： RNA模板质量：检查RNA是否降解；确保模板用量在推荐范围内（10 pg–2 μg）。 模板类型：确认使用的是总RNA或富集miRNA，而非已去除小RNA的RNA样品。 反应体系：确认各组分是否正确添加，关键酶组分是否置于冰上操作。 反应程序：确认孵育温度和时间是否正确。
本产品与常规逆转录试剂盒有何不同？
①本产品专门针对miRNA短序列（21–23 nt）设计，采用加A尾法使miRNA获得Poly(A)尾后进行逆转录； ②加尾与逆转录一步完成，操作简便； ③一次逆转录可检测多种miRNA，实现高通量检测； ④配备通用反向引物，只需设计特异性正向引物即可进行qPCR检测。
