原核表达载体构建是分子生物学和基因工程中的核心技术，指的是将目的基因（外源基因）插入到特定载体（环形质粒）上，构建成重组载体，从而使其在原核生物——通常是大肠杆菌（E.coli）内进行相应表达。
首先设计含有同源臂和特异性序列的引物，通常应遵循以下原则：
①引物5'端包含15~25 bp与载体末端同源的序列，对于多片段重组，更长的同源臂（≥30bp）可显著提高正确重组率；
②3'端为与目的基因特异性结合的序列；
③总长度35-75bp；
之后从cDNA文库、基因组DNA或现有质粒中扩增获得目的片段，扩增过程中需兼顾产物的产量、特异性和保真度。
载体需经过线性化处理，暴露出与PCR产物末端互补的同源序列，从而参与重组反应。常用方法包括限制性内切酶单酶切/双酶切消化，以及反向PCR扩增。
无缝克隆不同于传统的酶切连接法——后者依赖限制性内切酶在特定序列处制造黏性末端，再通过DNA连接酶将载体与片段共价连接。
经典的无缝克隆利用三种酶的协同作用（Gibson Assembly）：T5外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶；
利用T5核酸外切酶的5'→3'消化活性，在载体和片段的双链DNA末端产生3'单链突出端。当载体与片段在末端区域存在相同序列（即引物中引入的同源臂）时，两者的3'突出端通过碱基互补配对发生退火，形成带有缺口的环状中间体。随后，DNA聚合酶填补单链缺口，DNA连接酶封闭切口，完成共价闭合的环状重组质粒的构建。
配制10 μL重组体系时应遵循以下原则：
①载体和片段的总量≤200 ng；
②载体与插入片段摩尔比建议为1:3附近。
在实际操作中，若载体用量为50 ng（长度约5 kb），则1 kb的插入片段推荐用量约为30 ng（1:3摩尔比），可在20-40 ng范围内根据实验需求调整。
根据重组载体的抗性，将无缝克隆反应产物加入到合适的感受态细胞中，通过抗生素筛选获得含重组载体的单菌落，再经菌落PCR或测序确认插入片段的正确性。
推荐操作条件为：取5-10 μL重组反应产物加入50 μL感受态细胞中，冰浴30分钟，42°C热激45秒，立即冰浴5分钟后加入到500μL LB或SOC培养基，37°C震荡培养40 min，涂布于含对应抗生素的平板，37°C培养至出现单菌落。次日挑取单菌落进行菌落PCR（使用载体通用引物或基因特异性引物）或送测序验证。
获取目的片段
准备线性化载体
无缝克隆
转化与验证
