染料法荧光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）是分子生物学中检测和定量目标核酸序列的核心技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、SNP分型及拷贝数变异分析等领域。其原理基于DNA聚合酶在延伸过程中掺入荧光染料（如SYBR Green I），染料与双链DNA结合后发出荧光信号，荧光强度与PCR产物的累积量成正比，从而实现对起始模板量的实时监测与精确定量。
高质量的RNA是准确定量的前提。RNA的提取通常应遵循以下原则：
①使用无RNase的耗材与试剂，提取过程中需避免RNase污染；
②理想的总RNA在琼脂糖凝胶电泳成像中应呈现清晰的28S和18S rRNA条带，且亮度比约为2:1；
③通过分光光度计测定A260/A280比值，纯RNA应在1.8-2.1范围内；A260/A230比值应大于1.5，以排除有机溶剂或盐类污染；
④RNA样品应尽快进行反转录，或于-80°C保存以避免降解。
以mRNA为模板，利用反转录酶合成互补DNA（cDNA），作为后续qPCR的模板。
根据实验需求选择oligo(dT)引物或基因特异性引物。前者适用于具有poly(A)尾的mRNA，随机六聚体引物适用于无poly(A)尾的RNA或原核RNA；后者则用于特定转录本的靶向反转录。常规反转录酶通常在42-50°C反应，耐高温反转录酶可提升至55°C甚至更高，以克服RNA二级结构的阻碍。
引物的特异性与扩增效率直接决定定量结果的可靠性，在设计引物时，通常应遵循以下原则：
①扩增产物长度控制在80-200 bp，过长会降低扩增效率，过短则难以通过熔解曲线区分特异性产物与非特异性产物；
②上下游引物Tm差值不超过2°C；
③引物3'端避免连续出现三个或以上的G/C碱基，以减少非特异性扩增；
④引物设计应跨越内含子或位于不同外显子交界处，或在基因组DNA上跨越长内含子，以排除基因组DNA污染对定量结果的干扰；
⑤正式实验前需通过常规PCR验证引物特异性，确保单一清晰条带。
染料法qPCR利用SYBR Green I等荧光染料嵌入双链DNA后发光，通过实时监测荧光信号强度反映产物的累积。
配制20 μL qPCR反应体系时应遵循以下原则：
①模板cDNA的加入量应适中，通常反转录产物稀释5-10倍后取1-2 μL，避免高浓度模板中的抑制成分影响扩增效率；
②引物终浓度通常为0.2-0.4 μM，过高易导致引物二聚体形成，过低则降低扩增效率；
③循环程序通常设置为：预变性95°C 30秒至3分钟；变性95°C 10-15秒，退火/延伸60°C 30-60秒，共40个循环；熔解曲线分析从60°C缓慢升温至95°C。
扩增效率（Efficiency）应在90%-110%范围内（对应标准曲线斜率约为-3.1至-3.6），相关系数R²应大于0.98。熔解曲线应呈现单一尖锐峰，若出现多峰或肩峰，提示存在非特异性扩增或引物二聚体。
qPCR数据的可靠性依赖于严谨的内参选择与质控标准。
通常应遵循以下原则：
①选择表达稳定的内参基因（如GAPDH、β-actin、18S rRNA等），必要时采用多个内参基因进行归一化；
②采用相对定量法（2^-ΔΔCt法）比较不同样品间的基因表达差异，需确保目标基因与内参基因的扩增效率接近；
③每个样品设置至少三个技术重复，Ct值标准差应小于0.5；
④设置无模板对照（NTC）以检测体系污染，设置无反转录对照（-RT）以排除基因组DNA污染。
RNA提取与质量控制
反转录合成cDNA
引设计物
定量PCR反应
数据分析与质控
